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Point Technologique : Quantification label-free

Depuis 2011, la plate-forme Protéome propose l'approche de protéomique quantitative : la technologie label-free.

Plusieurs approches de protéomique quantitative permettent d’analyser l’expression des protéines cellulaires en fonction des modifications de l’environnement. Il est ainsi possible de comparer les protéomes de plusieurs états physiologiques distincts (malade/sain/traité/non traité) en mesurant l’apparition, la disparition ou les variations des quantités en protéines. Deux stratégies principales en protéomique quantitative ont été développées.

La première est basée sur la séparation préalable des protéines par électrophorèse bidimensionnelle et la seconde sur l’analyse directe des protéines par spectrométrie de masse. Dans ce dernier cadre, il existe deux grandes stratégies : la quantification relative des protéines avec marquage isotopique (*) et la quantification relative des protéines sans marquage. Dans le cadre de cette dernière stratégie, la technologie label-free est basée sur la comparaison des intensités des signaux MS pour apprécier l’abondance relative des protéines issues de chaque échantillon. Cette approche récente suscite un grand intérêt car elle permet d’obtenir une quantification relative fiable des protéines contenues dans plusieurs mélanges complexes.

La quantification des protéines dans un mélange complexe par label-free repose sur la digestion préalable des protéines par la trypsine. Ces peptides trypsiques sont ensuite séparés par chromatographie liquide pour alimenter en continu un spectromètre de masse qui effectue alternativement des spectres MS et des spectres de fragmentation (MS²) des ions observés sur le spectre MS. Ces spectres MS et MS² permettent respectivement d’apprécier la quantité relative des peptides trypsiques analysés et de les identifier. Ainsi, un peptide donné est élué progressivement de la colonne chromatographique, donnant d’abord un signal faible sur un premier spectre MS puis un signal qui évolue en augmentant puis en s’atténuant et enfin en disparaissant sur les spectres MS suivants (voir figure 1).

Si nous ne reviendrons pas ici sur la manière dont les peptides sont identifiés à partir des spectres MS², l’utilisation du signal MS pour quantifier relativement un peptide dans 2 conditions est présentée sur la figure 2 et repose sur une simple intégration du signal LC-MS. Ce signal qui traduit l’élution chromatographique du peptide peut, lors de l’analyse, être intégré pour apprécier la quantité relative du peptide considéré dans l’échantillon. Il est enfin possible de comparer les quantités relatives du même peptide dans différents mélanges complexes.

Comme toute méthodologie, la technologie label-free présente des avantages et des inconvénients. Parmi les avantages, la possibilité de comparer plusieurs échantillons biologiques constitue un atout majeur du label-free. De plus, elle peut être appliquée à tous les types d’échantillons. L’absence de marquage apporte de surcroît une simplicité non négligeable. La possibilité de coupler cette méthodologie à du fractionnement protéique par exemple sur gel SDS-PAGE permet désormais d’atteindre une profondeur très importante dans la description de l’échantillon.

Les inconvénients ne doivent pas pour autant être oubliés. La comparaison des signaux LC-MS nécessite une reproductibilité importante. Si la reproductibilité du signal MS est facile à mettre en œuvre sur les nouvelles générations de spectromètre de masse, il en va autrement de la chromatographie liquide. Comme nombre de stratégies analytiques faisant intervenir la spectrométrie de masse, le label-free quantifie avant tout des peptides. Le lien entre le ou les peptides et la protéine d’origine n’est pas toujours évident (isoforme, variant …).

Enfin, le label-free compare des échantillons ayant été traités en parallèle pour n’être réunis qu’au terme de l’analyse à l’étape bioinformatique. La variation d’intensité inhérente à la technique et plus généralement au traitement des échantillons est donc grand et impose de multiplier les réplicats en leur associant une analyse statistique pour ne retenir que les candidats significativement différent.

L’analyse des données label-free n’est possible que par l’utilisation d’outils bioinformatiques performants, outils dont la Plateforme Protéome est désormais équipée.