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Description des Prestations

La Plateforme Protéome s’appuie sur une équipe de Recherche spécialisée dans l’analyse des biomolécules et propose des prestations centrés autour de la séparation et de l’analyse des protéines. La Plateforme Protéome met également à disposition de la communauté scientifique des instruments couvrant une palette de méthodologie importante.

Prise de contact

Pour les demandes de prestation de service et les projets nouveaux, ils doivent faire l’objet d’une demande auprès de Caroline Tokarski.
Les autres demandes peuvent être effectuées directement auprès des opérateurs A-M. Lomenech, J-W. Dupuy ou S. Claverol. Vous trouverez la fiche de demande d'analyse à remplir (zone verte à remplir par les clients) : Fiche de demande d'analyse.
Les Demandes d'analyse sont émises par le client auprès de la Plateforme. Le personnel Plateforme compétent étudie la faisabilité des analyses après, si nécessaire, une discussion avancée ou réunion entre les partenaires pour compléter la demande d'analyse. Le responsable de la Plateforme désigne un "contact" au sein de la Plateforme qui sera l’interlocuteur privilégié de l’utilisateur. L'utilisateur valide la demande d'analyse (cahier des charges, type de prestation, échéancier).

Les demandes concernant la mise à disposition des équipements sont à formuler auprès de J-W. Dupuy.

Réception des échantillons

Des « Conseils et précautions autour de la préparation des échantillons » sont donnés à titre d’information sur cette page. Nous conseillons fortement aux utilisateurs de suivre ces quelques règles afin de se placer dans les conditions optimales pour l’obtention d’un résultat pertinent.

  • Réception des échantillons (solution, gel, bande/spot) sur place (aux heures ouvrées) ou via envoi postal (-20°C pour les échantillons en solution, envoie de morceau de gel à température ambiante dans 1% acide acétique).
  • Stockage immédiat des échantillons à la température adéquate (-20°C pour les échantillons en solution, 4°C pour les gels et spots/bandes). Possibilité de stockage à -80°C sur demande.
  • Suivi des échantillons et des enregistrements selon une nomenclature précise.

La Plateforme Protéome accepte de traiter des morceaux de gels colorés au nitrate d’argent. Dans ce cas, la Plateforme Protéome ne pourra être tenue comme responsable en cas de non succès de l’analyse.

En cas d’échantillons en solution, l’utilisateur évitera la présence dans ses échantillons de sels, de glycérol, de détergents ou encore de polymères. A défaut, l’utilisateur indiquera à la Plateforme la présence et la concentration de ces contaminants.

Pour la spectrométrie de masse, les seuls contenants acceptés sont les tubes ou microplaques en polypropylène non coloré. L’utilisateur s’assurera de l’étanchéité de ses tubes ou de sa plaque.

 

Réalisation de la prestation

Préparation d’échantillon Préparation des échantillons en adéquation avec les stratégies technologiques choisies par le client.
Dosage Bradford Une courbe étalon sera réalisée à chaque dosage.
Electrophorèse monodimensionnelle SDS-PAGE, BN-PAGE, 16-BAC-PAGE, IEF Des marqueurs de poids moléculaires non colorés sont déposés sur chaque gel et permettent de s’assurer de la qualité de la séparation électrophorétique et de l’efficacité de la coloration.
Electrophorèse bidimensionnelle BN/SDS-PAGE, 16-BAC/SDS-PAGE, IEF/SDS-PAGE Petite (Système Invitrogen), IEF/SDS-PAGE Grande (Système Amersham)  
Coloration Coomassie Blue, Colloidal Blue, Silver (MS Compatible), Pro Q Diamond, Ruthenium II, Sypro, Deep Purple Des marqueurs de poids moléculaires non colorés sont déposés sur chaque gel et permettent de s’assurer de la qualité de la séparation électrophorétique et de l’efficacité de la coloration.
Analyse d’image Les gels sont numérisés sur le scanner adapté à la méthode de coloration choisie. Les images de gel sont envoyées par défaut au format .jpeg. Les données brutes sont conservées et sont envoyées sur demande au format du choix de l’utilisateur.
Isoelectrofocalisation en veine liquide Rotofor grande cuve, Rotofor petite cuve, Offgel 12 fractions, Offgel 24 fractions Une courbe de pI est réalisée à partir de l’ensemble des fractions collectées.
Western blot Les anticorps primaires sont fournis par l’utilisateur.
Préparation des échantillons pour la Spectrométrie de Masse Campagne de protéolyse bihebdomadaire dans un environnement maitrisé permettant de limiter les possibilités de contaminations « kératine ». L’endoprotéase utilisée par défaut est la trypsine.  Le choix de l’endoprotéase peut être adapté à l'échantillon ou à l’application souhaitée par le client.
Analyse LC-MS/MS (gradient normal) sur LTQ Orbitrap XL (cas des échantillons simples à moyennement complexes) Analyse LC-MS/MS (gradient allongé) sur Q-Exactive (cas des échantillons très complexes) Identification des protéines par couplage nanoLC-ESI-MS/MS sur LTQ Orbitrap XL ou Q-Exactive. La durée du gradient chromatographique est adaptée à la complexité de l’échantillon. Les données sont interrogées via Proteome Discoverer 1.4 contre la banque de données la mieux adaptée. Le choix de la durée du gradient et de la banque de données est réalisé en concertation avec le client. Dans le cas de mélanges complexes, un taux de faux positif est mesuré. Les résultats incluent les protéines identifiées sur la base de peptide unique. Les couplages LC-MS sont qualifiés hebdomadairement tant du point de vue des performances chomatographiques que de la sensibilité en spectrométrie de masse.
Analyse MALDI (+8 MS/MS) Identification des protéines par MALDI-TOF MS/MS : L’analyse par cartographie peptidique est systématiquement associée à une validation MS/MS des protéines identifiées en 1ère approche. Les données sont interrogées via Mascot (licence locale) contre la banque de données la mieux adaptée (Concertation avec le client).
Marquage iTRAQ 4-Plex ou 8-Plex (Option avec fractionnement OffGel)  
Analyse Label-Free Les analyses quantitatives de type Label-Free sont conduites sur un spectromètre de masse de type LTQ Orbitrap XL ou Q-Exactive avec des gradients longs de 105 minutes. Les données LC-MS/MS sont ensuite alignées via le logiciel Progenesis QI (NonLinear Dynamics). Les pics détectés sont intégrés et les données quantitatives sont statistiquement validées. Seuls les peptides présentant une ANOVA inférieure à 5% sont retenus et pris en compte dans le calcul de l'intensité de la protéine (somme de l'intensité des peptides). Une nouvelle validation statistique est appliquée au niveau protéique permettant de ne retenir que les protéines dont l'ANOVA est elle aussi inférieure à 5%. Enfin, seules les protéines quantifiées sur la base de 2 peptides (et plus) sont retenues. Les bilans sont donnés sous format excel.
Recherche de phosphorylation (MS3, MS² ETD) Le choix de la méthodologie se fera en concertation avec l’utilisateur.
Séquençage de novo  
Mesure de masse moléculaire de protéines  

 

Rendu des résultats

Vous recevrez un courriel contenant des instructions pour télécharger de manière sécurisée (mots de passe) vos résultats sur le serveur ftp de l’Université de Bordeaux pendant une durée limitée. Sur demande, les résultats peuvent être communiqués à l’utilisateur sur le support de son choix. L'ensemble des fichiers est sous format de compression .zip. Les bilans protéiques sont présents au format .xlsx. Les bilans précisant le traitement complet des échantillons et les conclusions formulées par le personnel de la Plateforme sont envoyés au format .docx.

Des documents mis en ligne sur le site web de la Plateforme peuvent aider à la compréhension des résultats (Description des résultats obtenus avec Proteome Discoverer) mais le personnel de la Plateforme reste à l’entière disposition des utilisateurs pour répondre à toutes les questions soulevées et les assister dans les étapes de valorisation des résultats.

La plateforme considère que, sans réponse sous 10 jours de la part du client, le dossier comme accepté et clos.

La Plateforme s’engage à ne divulguer aucune information relative au projet autre que le nom de l’utilisateur et le titre du projet. Sur demande, le titre du projet peut lui aussi être confidentiel.

La Plateforme Protéome n’assure la conservation des échantillons que pendant la durée de réalisation de la prestation. Les conditions de conservation des échantillons sont spécifiées par le client dans la demande d’analyse. Dans le cas contraire, les échantillons biologiques sont conservés à -20°C. Les gels sont systématiquement conservés à 4°C. Le client peut également spécifier s’il souhaite récupérer les échantillons restants. Dans le cas contraire, les échantillons seront éliminés dans le cadre de la filière d’élimination des déchets biologiques.

Plateforme Protéome n’assure la conservation des données brutes que pendant la durée de réalisation de la prestation. Le client, s’il souhaite pouvoir disposer des données brutes, doit le spécifier dans la demande d’analyse.

Service après livraison

La plateforme et ses membres proposent aux porteur de projets d’organiser une réunion de clôture pour présenter les résultats et les suites à donner. Le porteur de projet peut faire la demande de cette réunion de clôture auprès de son contact ou du responsable de la PF.
Sous réserve que les données brutes soient toujours disponibles, la PF peut réinterroger les données brutes. Les demandes de réinterrogation devront être motivées et adressées au responsable de la structure directement.
Dans le cadre d’une valorisation des résultats issus de la PF, la PF s’engage à rédiger le matériel et méthode correspondant et à aider les porteurs de projets dans l’exploitation des résultats