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FAQ

 

Si nous nous efforçons, à la Plateforme Protéome, d’adapter les réponses apportées à chaque échantillon et à chaque problématique, certaines questions amènent souvent les mêmes réponses. En voici quelques exemples.

Quels sont les services proposés par la Plateforme Protéome ?

La Plateforme Protéome met à la disposition des équipes de recherche de la région Aquitaine ses outils et ses compétences dans la purification, la séparation, l’identification et la caractérisation des protéines.

Sous quelle forme ces services sont-ils proposés ?

Plusieurs niveaux d’implication sont possibles. Soit les échantillons soumis peuvent être entièrement traités par l’équipe de la Plateforme Protéome. Soit l’équipe de recherche peut demander à être associée au traitement de l’échantillon voire à être formée aux techniques et méthodologies proposées par notre service.

Comment ces services sont-ils facturés ?

Une fois le service effectué, une facture proformat est adressée à l’équipe pour laquelle ce service a été mené. Le porteur de projet émet alors un bon de commande permettant l’édition de la facture par le secrétariat de la Plateforme Protéome.
Les prestations sont rendues soit sous forme de collaboration soit sous forme de service. Dans le cas d'une collaboration, le laboratoire porteur du projet scientifique assume les frais de fonctionnement. Dans le cas d'un service, le laboratoire porteur du projet scientifique assume non seulement les frais de fonctionnement mais aussi les frais d'expertise. Dans tous les cas nous consulter pour connaître les tarifs.

Quelle est la quantité minimale de protéine pour une identification?

S’il est difficile de répondre de manière empirique à cette question, on considère généralement que la protéine doit être visible sur gel. Si une protéine visible au bleu de Coomassie (~0.1 µg) conduit généralement à une identification, le Plateforme Protéome ne peut garantir un résultat pour des protéines visibles seulement par des méthodes de coloration plus sensibles (Bleu Colloïdal, Nitrate d’Argent, Sypro). En effet, dans ce cas, la technique devient « protein-dependent » et certaines protéines seront identifiées tandis que d’autres ne le seront pas. De manière générale, plus la protéine est abondante, meilleure sera l’identification. Ceci est d’autant plus vrai lorsqu’on cherche à couvrir un maximum de la séquence de la protéine (recherche de variants ou de modifications post-traductionnelles). Dans ce dernier cas, il faut en effet prévoir de plus grande quantité de protéine.

Quel protocole de coloration dois-je utiliser pour colorer mon gel?

En référence à la question précédente, la coloration qui conduit aux meilleurs résultats d’identification en spectrométrie de masse est la coloration au bleu de Coomassie. La plupart des autres méthodes de colorations des gels reste cependant compatible avec la spectrométrie de masse.
Attention toutefois : dans le cas des colorations au nitrate d’argent, de nombreux protocoles ont été publiés. Il est impératif d’utiliser un protocole sans étape de fixation faisant intervenir le glutaraldehyde ou le formaldehyde aux étapes de sensibilisation et de coloration.

Quelle doit être la pureté d’un échantillon destiné à une analyse en spectrométrie de masse ?

Si la technique d’identification par cartographie peptidique est limitée à l’analyse de protéines isolées, la stratégie LC-MS/MS est plus adaptée à l’analyse de mélange. Cependant, une protéine peu abondante au sein d’un mélange très complexe peut ne pas être identifiée. Il s’avère donc parfois nécessaire de mettre en place des procédures de purification devant permettre l’élimination des protéines très abondantes (actine, tubuline, …). De la même manière, il convient de limiter les risques de contamination par les kératines, principal contaminant en spectrométrie de masse (cf. « Les contaminations kératines »).
En terme de présence de sels, détergents et autres agents de conservation, des limites de concentration sont données à titre indicatif (cf. Détergents en ESI ; Détergents et sels en MALDI).

Peut-on séquencer une protéine par spectrométrie de masse ?

La stratégie protéomique classique consiste, en mode MS/MS, à identifier une protéine sur la base des informations de séquence et non pas à partir de la séquence elle-même. Malgré tout, il est possible de faire du séquençage « de novo » sur certains peptides afin d’en extraire de courtes séquences appelées « tags peptidiques ». Ce séquençage, qui résulte de l’analyse fine du spectre obtenu en fragmentant le peptide d’intérêt, peut dans certains cas conduire à la construction de sondes nucléotidiques qui à leur tour permettront d’aller chercher le gène en question.

Je souhaite découper les spots moi-même. Quelles précautions dois-je prendre ?

Les règles élémentaires à respecter sont présentées sur cette page. En résumé, il est impératif de prendre toutes les précautions pour protéger le gel (et tout ce qui rentre en contact avec lui) de la poussière, de la peau et des cheveux. Enfin, il est toujours préférable de maximiser le rapport protéine/acrylamide : pour une même quantité de protéine, un petit spot concentré est préférable à un spot plus grand mais moins concentré.

Sous quelle forme puis-je vous soumettre les échantillons ?

La Plateforme Protéome accepte tout type d’échantillon (gel entier, morceau de gel, échantillon en solution, …) à condition que ces échantillons aient été traités dans le respect des précautions précédemment citées. Les gels ne doivent pas être séchés mais conservés dans Acide Acétique 1%.

Comment comprendre les résultats de masse issus de Proteome Discover ?

Vous trouverez sur ce document excel les explications de chaque colonne : Document d'aide
L’ensemble du personnel de la Plateforme Protéome se tient à votre disposition pour répondre à vos questions et vous aider dans la compréhension des différentes pièces jointes au rapport final. Sur demande de votre part, une réunion bilan pourra être organisée