Aller au contenu principal

Protocoles

Les contaminations keratine

Afin de maximiser les chances de succès des analyses de protéines  en spectrométrie de masse, il est vivement conseillé de préparer les échantillons selon les recommandations ci-dessous.

Vous : Les kératines viennent de la peau, des cheveux et des vêtements.

  • Le port de la blouse et de gants propres est indispensable tout au long de la manipulation.
  • Les gants doivent être renouvelés à chaque manipulation.
  • Eviter le port de pulls en laine, mohair…

Le matériel : Les kératines proviennent des poussières en suspension.

  • Le matériel et la vaisselle entrant en contact avec le gel doivent être lavés avec un détergent, rincés à l’eau ultrapure et séchés à l’éthanol.
  • Tout le matériel doit être rangé à l’abri de la poussière.
  • Dans la mesure du possible, manipuler sous une hotte à flux laminaire.

Les solutions : Les solutions elles-mêmes peuvent être source de kératines.

  • Utiliser de préférence des microtubes de 1.5 ml en polypropylène transparent.
  • Utiliser des produits neufs qui seront exclusivement consacrés aux gels.
  • Les cones seront réservés à un usage protéomique. Porter des gants!
  • Utiliser de préférence des boites de cônes pré-remplies pour éviter toute manipulation des embouts de pipette.

Le gel : Avoir un maximum de protéine dans un minimum d’acrylamide.

  • Utiliser si possible des gels de faible épaisseur (0.75mm).
  • Pour les gels 1D, charger les puits vides avec du tampon Laemmli pour limiter la diffusion des protéines sur les cotés lors de la migration.
  • Conservation du gel dans 1% acide acétique à 4°C.
  • Préférer la coloration au bleu de Coomassie à celle au nitrate d’argent.
  • En cas de coloration au nitrate d’argent, traiter les échantillons au plus vite.


Précipitation :

Précipitation Acétone :

  • Ajouter 5 volumes d’acétone glacial sur l’échantillon
  • Vortexer et incuber 30 min à -20°C
  • Centrifuger 15 min à 20000 g
  • Eliminer le surnageant, on doit voir une traînée
  • Laisser sécher à T° ambiante (ne pas attendre trop longtemps, le culot sera difficile a reprendre
  • Reprendre dans un volume adéquat

Précipitation TCA :

  • Amener la solution à 15 % (w/v) TCA
  • Vortexer et incuber 30 min à 4°C
  • Centrifuger 15 min à 13000 g
  • Eliminer le surnageant, on doit voir une traînée
  • Laver avec de l’acétone glacial (environ 1 ml)
  • Centrifuger 10 min à 13000 g
  • Relaver avec de l’acétone glacial (environ 1 ml)
  • Centrifuger 10 min à 13000 g
  • Enlever le surnageant et laisser sécher à T° ambiante
  • Reprendre dans un volume adéquat

Précipitation Ethanol :

  • Ajouter 2 volumes d’EtOH glacial sur l’échantillon
  • Vortexer et incuber 30 min à -20°C
  • Centrifuger 15 min à 20000 g
  • Eliminer le surnageant, on doit voir une traînée
  • Laver avec de l’EtOH glacial
  • Vortexer et centrifuger 15 min à 20000 g
  • Enlever le surnageant et laisser sécher à T° ambiante
  • Reprendre dans un volume adéquat

Précipitation Méthanol d’échantillon solubilisé au Triton X114 1%(w/v) :

A la solution de triton, ajouter 9 volumes de méthanol froid absolu.
Apres une nuit a -70 °C, centrifuger a 12 000 g pendant 10 min.
Le culot est repris dans le tampon de charge.

 

Coloration Bleu Colloïdal

Le mélange se fait sous agitation légère et dans l’ordre qui suit :

  • Mélanger 16 ml d’Acide Ortho phosphorique (ex: Fluka, ref 79617) dans 770 ml d’eau ultrapure.
  • Dissoudre 80 g de Sulfate d’ammonium (ex: Fluka, ref 09980)
  • Préparer une solution de Bleu G250 (ex: BioRad, ref 161-0406) à 5%(p/v) dans de l’eau ultrapure.
  • Ajouter 16 ml de cette solution bleue au premier mélange.

Une fois que le gel est prêt à être coloré, ajouter à la solution 20% du volume avec de l'éthanol, et utiliser aussitôt.
Le colorant ne se conservant pas, ne préparer que le volume nécessaire. Mettre le gel à colorer pour 6 heures minimum.
La décoloration se fait par bain successifs d’eau ultrapure jusqu’à que le fond devienne transparent.

NB : les concentrations finales sont :
CBB G250 0.8 % (p/v)
Acide Ortho phosphorique 1.6% (v/v)
Sulfate d’ammonium 8% (p/v)
Ethanol 20% (v/v)

 


Détergents en ESI

Données extraite de R.R. Ogorzalek Loo, N. Dales and P.C. Andrews, Protein Science 3(1994)1975-1983.
L’effet de plusieurs détergents sur l’ionisation électrospray a été étudié. Une solution de myoglobine à 6 µM dans eau/ACN/AcOH 50/46/4 v/v/v a ainsi été analysée en présence de différents détergents (0.01%, 0.1% et 1.0%).

  • A une concentration en détergent de 1.0% (w/v), la plupart des détergents éteignent le signal à l’exception des détergents saccharidiques qui réduisent le signal d’un facteur 10.
  • A une concentration en détergent de 0.01% (w/v), seul le SDS et le sodium taurocholate affectent le signal (réduction d’un facteur 20).
  • A une concentration en détergent de 0.1% (w/v), le rapport entre le signal en présence et en l’absence de détergent est donné pour chacun d’entre eux dans la table ci-dessous.

Détergent/Signal

  • sodium dodecylsulfate (SDS) : <10%
  • sodium taurocholate : <10%
  • sodium cholate : 21-30%
  • CTAB : <10%
  • LDAO : <10%
  • CHAPS : 31-60%
  • Tween 20 : 10-20%
  • Thesit : <10%
  • Triton X-100 : <10%
  • NP40 : <10%
  • n-octyl sucrose : 10-20%
  • n-dodecyl sucrose : 10-20%
  • n-dodecyl maltoside : 21-30%
  • octyl glucoside : 21-30%
  • octyl thioglucoside : 21-30%
  • n-hexyl glucoside : 30-60%
  • n-dodecyl glucoside : >60%


Détergents et sels en MALDI

Les données suivantes ont été extraites de Vorm, Ole, Brian T. Chait and Peter Roepstorff, Mass Spectrometry of Protein Samples Containing Detergents, 41th ASMS Conference Proceedings, (1994) 621a-621b. Elles comparent les effets relatifs des détergents sur la qualité du signal en MALDI-MS. Ces données prennent en compte des concentrations "utiles" de détergents et non pas seulement des traces.

Classe/Effet sur le spectre MALDI

  • 1 = aucun effet négatif: peut améliorer la qualité du spectre
  • 2 = peu d’effet
  • 3 = intensité du signal et rapport signal/bruit sont réduits
  • 4 = suppression spectrale: détergents à éviter absolument

Détergent/Classe

  • n-octyl-glucoside = 1
  • n-dodecyl-glucoside = 1
  • octanoyl-N-methylglucamide = 1
  • decanoyl-n-methylglucamide = 1
  • n-dodecyl-beta-D-maltoside = 2
  • octylphenolpoly(ethyleneglycolether)10 (Triton X-100) = 3
  • octylphenolpoly(ethyleneglycolether)7 (Triton X-114) = 3
  • polyethylene glycol (PEG 2000) = 3
  • dodecylpoly(ethyleneglycolether)9 (Thesit) = 4
  • isotridecylpoly(ethyleneglycolether)8 = 4
  • CHAPS = 4
  • CHAPSO = 4
  • n-dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate = 4
  • sodium dodecylsulfate (SDS) = 4

NOTE: De basses concentrations de SDS dans une solution peuvent être tolérées. Cependant, la plupart des échantillons de protéine contenant du SDS ont été bouillis dans 0,1% SDS. Dès lors, les propriétés de la solution changent. La protéine est désormais « encapsulée » dans le SDS et enlever l’excès de SDS n’est pas suffisant dans le cas d’une analyse MALDI. Il faut alors recours à d’autres méthodes de dessalage. La précipitation en acétone n'a aucun effet car le SDS est insoluble en acétone.

Plus un échantillon est pur et meilleure sera la qualité du spectre MALDI. Des méthodes de dessalage par microchromatographie donnent des résultats satisfaisants.

S’il n’est pas possible d’éliminer la totalité des sels, tenter de maintenir la concentration des ces sels dans les limites ci-dessous.

  • Tampon Phosphate : <50 mM
  • Ammonium bicarbonate : <30 mM
  • Tris : <100 mM
  • Guanidine : <1M
  • SDS : <0.01%
  • Autres détergents, (Triton X-100, etc) : <0.1%
  • Sels alcalins : <1M
  • Glycerol : <1%
  • Sodium azide : <1mM