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Prestation de Recherche

Présentation générale

La Plateforme Protéome (PP) propose une expertise et des équipements pour la séparation, l’identification et la caractérisation des protéines, la quantification et l’analyse différentielle ou encore la recherche de partenaires protéiques.

L’analyse des protéines est réalisée par la méthodologie dite « bottom-up » à partir d’équipements couplant la nano-chromatographie liquide à des spectromètres de masse de dernière génération équipés d’analyseurs de type Orbitrap. Ces nouvelles générations d’analyseur permettent une analyse à très haute résolution et à très haute vitesse de balayage pour une sensibilité optimale autorisant l’analyse d’échantillons complexes voir très complexes.

Concernant la protéomique quantitative/différentielle, la PP offre la possibilité d’analyser vos échantillons par la technique label-free qui permet de comparer plusieurs échantillons sans étape de marquage des protéines/peptides. Le choix du design expérimental (label-free, SILAC, TMT,…) est cependant guidé par différents facteurs dont le type d’échantillons (cultures cellulaires, tissus…), leur complexité, la quantité de matériel à disposition… Alternativement les méthodes de marquage isotopique sont également disponibles et permettent d’envisager un fractionnement protéique ou peptidique avec un minimum de biais expérimentaux à l’analyse.

L’analyse de protéines intactes (purifiées ou en mélange), est possible par l’approche dite « top-down », à partir des méthodes implémentées sur les dernières générations d’instruments disponibles au sein de la PP.

Pour l’étude des espèces non séquencées, la PP propose son expertise relative à l’identification des protéines par séquençage de novo. Différents logiciels spécifiques à ce type d’analyse sont disponibles.

Enfin, la PP propose différentes stratégies d’enrichissement et/ou d’analyse bio-informatique pour la caractérisation de modifications co/post-traductionnelles (i.e. phosphorylation, ubiquitination, glycosylation).

S’agissant de séparation des protéines, la PP propose des techniques électrophorétiques mono- (SDS-PAGE, BN-PAGE, 16-BAC-PAGE, IEF) ou bi-dimensionnelles (BN/SDS-PAGE, 16-BAC/SDS-PAGE, IEF/SDS-PAGE). Les gels peuvent être colorés au moyen de différents colorants visibles et fluorescents (Coomassie Blue, Colloïdal Blue, Silver (MS Compatible), Pro Q Diamond, Ruthenium II, Sypro, Deep Purple). Le transfert sur membrane des gels est également possible

La séparation des protéines en veine liquide par iso électrofocalisation (IEF) ou en fonction de leur masse moléculaire peut être réalisée sur des systèmes commerciaux disponibles, respectivement les système, OffGel, Rotofor ou GelFree.

La PP étant adossée à l’équipe de recherche Spectrométrie de Masse des Macromolécules Biologiques, UMR 5248 CBMN, des projets collaboratifs peuvent être menés autour des thématiques ci-après. Pour tous nouveaux projets sur les thématiques suivantes, veuillez contacter la responsable de l’équipe de recherche Caroline Tokarski et le responsable de la thématique.

 

  • Analyse structurale des protéines par échange isotopique ou cross-linking (responsable : Stéphane Chaignepain).
  • Imagerie par Spectrométrie de Masse (responsable : Nicolas Desbenoit).
  • Analyse des N- et O-glycoprotéines / glycopeptides (responsable : Katell Bathany)
  • Analyse de lipides (responsable : Corinne Buré).
  • Analyse par spectrométrie de masse en tandem de protéines intactes - protéomique de type « top-down » (responsable : Caroline Tokarski).
  • Analyse de traces et ultra traces dans le domaine du patrimoine culturel (responsable : Caroline Tokarski).

 Voir l’onglet « Expertises » pour plus de détails sur les prestations offertes par la PP.

 

Modalités de la prestation et tarifs

Avant de soumettre des échantillons, il est souhaitable de prendre contact avec la PP afin d’établir une stratégie d’analyse adaptée au contexte et mettre au point les conditions expérimentales (préparation et analyse).

Les projets nouveaux devront faire l’objet d’une demande auprès de Caroline Tokarski. Les autres demandes peuvent être effectuées directement auprès des opérateurs Anne-Marie Lomenech, Jean-William Dupuy ou Stéphane Claverol. Une fiche de demande d’analyse est disponible et devra être complétée afin d’étudier la faisabilité du projet (Demande d'analyse). Une réunion préparatoire pourra être organisée entre les partenaires si nécessaire. La responsable de la PP désigne un "contact" au sein de la Plateforme qui deviendra l’interlocuteur privilégié de l’utilisateur. L'utilisateur valide la demande d'analyse (cahier des charges, type de prestation, échéancier, devis, personnel PP impliqué).

Les prestations sont rendues soit sous forme de collaboration, soit sous forme de prestation de recherche :

  • Dans le cas d'une collaboration, le laboratoire porteur du projet scientifique assume les frais de fonctionnement. Dans ce cas, le personnel de plateforme impliqué est co-propriétaire des résultats et co-auteur des éventuelles publications scientifiques résultant de la collaboration.
  • Dans le cas d'une prestation de recherche, le laboratoire porteur du projet scientifique assume non seulement les frais de fonctionnement mais aussi les frais d'expertise. Dans ce cas, le laboratoire porteur du projet reste propriétaire exclusif des résultats.

Une définition du cadre strict de la prestation ainsi qu’un devis seront établis à chaque demande faite à la PP.

 

Réception des échantillons

Des « Conseils et précautions autour de la préparation des échantillons » sont donnés à titre d’information sur notre site web. Nous conseillons fortement aux utilisateurs de suivre ces quelques règles afin de se placer dans les conditions optimales pour l’obtention d’un résultat pertinent.

  • Réception des échantillons (solution, gel, bande/spot) sur place (aux heures ouvrées) ou via envoi postal (-20°C ou carboglace pour les échantillons en solution, envoie de morceau de gel à température ambiante dans 1% acide acétique).
     
  • Stockage immédiat des échantillons à la température adéquate : -20°C ou -80°C sur demande pour les échantillons en solution, 4°C pour les gels et spots/bandes).
     
  • Suivi des échantillons et des enregistrements selon une nomenclature précise.

La PP accepte de traiter des morceaux de gels colorés au nitrate d’argent. Dans ce cas, la PP ne pourra être tenue comme responsable en cas d’échec de l’analyse.

En cas d’échantillons en solution, l’utilisateur évitera la présence dans ses échantillons de sels, de glycérol, de détergents ou encore de polymères Cf renvoie vers protocole. A défaut, l’utilisateur indiquera à la PP la présence et la concentration de ces contaminants.

Pour la spectrométrie de masse, les seuls contenants acceptés sont les tubes ou microplaques en polypropylène non coloré et non traité. L’utilisateur s’assurera de l’étanchéité de ses tubes ou de sa plaque.

 

Réalisation de la prestation

Prestations Descriptif des prestations

Préparation des échantillons

La préparation des échantillons est réalisée en adéquation avec les stratégies technologiques choisies en concertation avec le porteur de projet. Le mode opératoire est communiqué au partenaire.

Dosage protéique

Le dosage protéique est réalisé par la technique de Bradford. Une courbe étalon est établie à chaque dosage.

Méthodes électrophorétiques et coloration des gels d’acrylamide

Si la technique électrophorétique choisie le permet, des marqueurs de poids moléculaires non colorés sont déposés sur chaque gel et permettent de s’assurer de la qualité de la séparation électrophorétique aussi bien que de l’efficacité de la coloration.

Analyse d’image

Les gels sont numérisés sur le scanner adapté à la méthode de coloration choisie. Les images de gel sont envoyées par défaut au format .jpeg. Les données brutes sont conservées et sont envoyées sur demande au format du choix de l’utilisateur.

Isoelectrofocalisation en veine liquide Pour toute isoelectrofocalisation en veine liquide, qu’elle soit réalisée sur système Rotofor, système Offgel ou encore système GelFree, une courbe étalon (pI, MW) est établie à partir de l’ensemble des fractions collectées.

Préparation des échantillons pour la Spectrométrie de Masse

Campagne de protéolyse hebdomadaire dans un environnement maîtrisé permettant de limiter les possibilités de contaminations « kératine ». L’endoprotéase utilisée est généralement la trypsine.  Le choix de l’endoprotéase peut être adapté spécifiquement à un projet.

Analyse LC-MS/MS

L’identification des protéines est réalisée par couplage nanoLC-ESI-MS/MS sur LTQ Orbitrap XL ou Fusion Lumos. La durée du gradient chromatographique est adaptée à la complexité de l’échantillon. Les données sont interrogées via Proteome Discoverer 2.4 / PEAKS contre la banque de données la mieux adaptée définie en concertation avec le porteur de projet. Le choix de la durée du gradient et de la banque de données est lui aussi réalisé en concertation avec le porteur du projet. Dans le cas de mélanges complexes, un taux de faux positif est mesuré. Les résultats incluent les protéines identifiées sur la base de peptide unique. Les systèmes de LC-MS/MS sont calibrés et qualifiés hebdomadairement tant du point de vue des performances chromatographiques que de la sensibilité du spectromètre de masse lui-même.

Analyse d’expression différentielle par Label-Free

Les analyses quantitatives de type Label-Free sont conduites sur un spectromètre de masse de type Fusion Lumos permettant une sensibilité et une vitesse de scan optimale pour l’analyse d’échantillons très complexes. Les données de LC-MS/MS sont ensuite traitées via le logiciel Proteome Discoverer pour l’identification et l’intégration des données quantitatives.  Les modalités de calcul des ratios et des tests statistiques sont établies en concertation avec le porteur de projet et les données brutes sont disponibles pour retraitement par le porteur du projet via le logiciel de son choix. Les bilans sont donnés sous format excel.

 

Rendu des résultats

Les résultats seront envoyés en version électronique via un courriel ou un serveur ftp. Sur demande, les résultats peuvent être communiqués à l’utilisateur sur le support de son choix. Les fichiers seront sous format *.zip, *.docx, *.xlsx ou *.pptx. Les bilans protéiques sont présents au format .xlsx. Les bilans précisant le traitement complet des échantillons et les conclusions formulées par le personnel de la Plateforme sont envoyés au format .docx.

Des documents mis en ligne sur le site web de la Plateforme peuvent aider à la compréhension des résultats (Description des résultats obtenus avec Proteome Discoverer) mais le personnel de la Plateforme reste à l’entière disposition des utilisateurs pour répondre à toutes les questions soulevées et les assister dans les étapes de valorisation des résultats.

La PP considère que, sans réponse sous 10 jours de la part du client, le dossier comme accepté et clos.

La PP s’engage à ne divulguer aucune information relative au projet autre que le nom de l’utilisateur et le titre du projet. Sur demande, le titre du projet peut lui aussi être confidentiel.

La PP n’assure la conservation des échantillons que pendant la durée de réalisation de la prestation. Les conditions de conservation des échantillons sont spécifiées par le client dans la demande d’analyse. Dans le cas contraire, les échantillons biologiques sont conservés à -20°C. Les gels sont systématiquement conservés à 4°C. Le client peut également spécifier s’il souhaite récupérer les échantillons restants. Dans le cas contraire, les échantillons seront éliminés dans le cadre de la filière d’élimination des déchets biologiques.

La PP n’assure la conservation des données brutes que pendant la durée de réalisation de la prestation. Le client, s’il souhaite pouvoir disposer des données brutes, doit le spécifier dans la demande d’analyse.

 

Service après livraison

La PP et ses membres proposent aux porteurs de projets d’organiser une réunion de clôture pour présenter les résultats et discuter des perspectives du projet. Le porteur de projet peut faire la demande de cette réunion de clôture auprès de son contact et/ou du responsable de la Plateforme.

Sous réserve que les données brutes soient toujours disponibles, la PP peut ré-interroger les données brutes. Les demandes de ré-interrogation devront être motivées et adressées au responsable de la structure directement.

Dans le cadre d’une valorisation des résultats issus de la PP, son personnel s’engage à rédiger le matériel et méthode correspondant et à aider les porteurs de projets dans l’exploitation des résultats.